PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN LA DETERMINACIÓN DE ETANOL EN BEBIDAS.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN LA DETERMINACIÓN DE ETANOL EN BEBIDAS.

La muestra es la porción de objeto donde se investiga el analito. Para que se considere muestra tiene que cumplir unos determinados requisitos:

• Representar fielmente las propiedades del objeto.
• Presentar un tamaño manejable.
• Mantener las mismas propiedades del objeto en el momento del muestreo o cambiarlas en la forma en que lo hacen las del objeto.
• Conservar sus propiedades durante el transporte y análisis.
• Transmitir la información requerida para resolver el problema.
Para investigar el analito, en nuestro caso el etanol, es necesario un método específico que permita detectar únicamente el analito problema y separarlo de las especies interferentes.
Si queremos determinar etanol en bebidas utilizaremos una técnica analítica de separación, que es un procedimiento para dejar el analito fuera de la acción de las sustancias que interfieren en su determinación. La técnica analítica utilizada es separación por destilación.
El fundamento de la separación por destilación es la distinta volatilidad de los componentes de la muestra (ron, cerveza, whisky, vino…). Las muestras de las que se puede examinar el etanol son liquidas por eso la separación se hace por destilación. En la destilación tenemos dos fases: liquido y gas. La fase gaseosa se genera o bien por calentamiento, o por la adicción de un reactivo o bien por ambos procesos a la vez.



CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA.

En muchos casos, la muestra no se analiza inmediatamente, sino que se almacena durante algún tiempo o se envía de una localidad a otra. Durante ese tiempo, se debe preservar la integridad de la muestra evitando que se produzca su degradación y/o pérdida de analitos. Las muestras se pueden alterar por manipulación, temperatura, agitación…por los que las muestras que sean propensas a alteraciones en su composición se deben analizar inmediatamente después de su recolección. En el casa de que esto no sea posible: se deberán etiquetar y almacenar en las condiciones más favorables, y en contenedores adecuados.

La elección del contenedor dependerá de:
- Estado físico de la muestra.
- Tipo de analito.
- Naturaleza del recipiente.




PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

1. Dilución de la muestra.

La cantidad de etanol presente en la cubeta (es decir, en los 0,1mL de la muestra que se está analizando) debe estar entre 0,25 y 12 μg. La solución de muestra debe por tanto diluirse lo suficiente para que resulte en una concentración entre 0,01 y 0,12 g/L.

2. Manipulación de la muestra.

Como el etanol es volátil, todas las operaciones deberían realizarse en lo
posible en botellas de vidrio selladas.

Es necesario tener mucho cuidado cuando se filtren, diluyan o echen en pipetas las soluciones. Las tiras de plástico de las pipetas se deben aclarar 3 veces con la solución antes de tomar la parte alícuota. Las cubetas y las tiras de plástico se deben aclarar 3 veces con agua destilada sin etanol y secarlas antes de utilizarlas.

3. Clarificación de la muestra.

a. Soluciones:

Solución Carrez I. Disuelva 3,60 g de hexacianoferrato de potasio (II)
{K4[Fe(CN)6].3H2O} (Sigma cat. no. P-9387) en 100 mL de agua destilada. Guárdelo a temperatura ambiente.

Solución Carrez II. Disuelva 7,20 g de sulfato de cinc (ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) en 100 mL de agua destilada. Guárdelo a temperatura ambiente.

Hidróxido sódico (NaOH, 100 mM). Disuelva 4 g de NaOH en 1 L de agua
destilada. Guárdelo a temperatura ambiente.

b. Procedimiento:

Vierta la muestra líquida en un matraz de 100 mL que contenga aproximadamente 60 mL de agua destilada, o pese suficiente cantidad de muestra en un matraz de 100 mL y añada 60 mL de agua destilada. Añada con cuidado 5 mL de solución Carrez I, 5 mL de solución Carrez II y 10 mL de solución de NaOH (100 mM). Mezcle cada vez que añada un componente. Llene el matraz hasta la marca, mezcle y filtre.

4. Consideraciones generales.


(a) Muestras líquidas: muestras claras, ligeramente coloreadas y aproximadamente neutras se pueden utilizar directamente en el ensayo.

(b) Muestras ácidas: Si se va a analizar más de 0,1 mL de muestra ácida sin diluí (como vino o fruta), el pH de la solución se debe aumentar a 9,0 aproximadamente, utilizando 2 M NaOH, y la solución incubada a temperatura ambiente durante 30 min.

(c) Dióxido de carbono: las muestras que contengan una cantidad significativa de dióxido de carbono, como la cerveza, se deben desgasificar aumentando el pH a aproximadamente 9,0 con 2 M NaOH, agitando suavemente.

(d) Muestras coloreadas: puede que sea necesario realizar una muestra adicional sin tratar, es decir, una muestra sin ADH, en caso de muestras coloreadas.

(e) Muestras muy coloreadas: Si se utilizan sin diluir, las muestras muy coloreadas se deben tratar añadiendo 0,2 g de PVPP por cada 10 mL de muestra. Agite durante 5 minutos y a continuación filtre con papel Whatman Nº 1.

(f) Muestras sólidas: homogeneizar o triturar muestras sólidas en agua destilada y filtrar si fuera necesario.

(g) Muestras que contengan grasas: extraiga dichas muestras con agua caliente a una temperatura por encima del punto de fusión de la grasa, p.ej. 100 mL en matraz a 60°C. Déjelo enfriar a la temperatura ambiente y rellene el matraz hasta la marca con agua destilada. Guárdelo en hielo o en un frigorífico durante 15-30 min y a continuación fíltrelo. Tire los primeros mL de lo que filtre, y utilice el sobrenadante claro (que puede estar ligeramente opalescente) para el ensayo. Otra alternativa es clarificar con reagentes Carrez.

(h) Muestras que contengan proteína: desproteinice las muestras que contengan proteína con ácido perclórico; también se puede clarificar con reagentes Carrez.

EJEMPLOS PARA PREPARAR LAS MUESTRAS:

(a) Determinación del etanol en el vino.
La concentración de etanol en el vino tinto y blanco en general se puede determinar sin tratar la muestra (salvo mediante dilución, según la tabla de dilución).
Normalmente, los vinos con 10-15 % (v/v) de etanol, una dilución de 1:1,000 y volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

Video de destilación del vino
http://www.youtube.com/watch?v=sbdQrfzVfZU




(b) Determinación del etanol en la cerveza, sidra y zumos de fruta con alcohol.
Después de eliminar el dióxido de carbono aumentando el pH de la solución a un valor aproximado de 9,0 con 2 M NaOH y agitando suavemente, diluya y analice la muestra según la tabla de dilución. Normalmente, las bebidas con 3-8 % (v/v) de etanol, una dilución de 1:500 y volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(c) Determinación del etanol en cervezas sin alcohol y con bajo contenido de alcohol y otras bebidas.
Después de eliminar el dióxido de carbono aumentando el pH de la solución a un valor aproximado de 9,0 con 2 M NaOH y agitando suavemente, diluya y analice la muestra según la tabla de dilución. Normalmente una dilución de 1:50 y un volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(d) Determinación del etanol en bebidas alcohólicas (whisky, brandy, etc).
La concentración de etanol en las bebidas alcohólicas en general se puede determinar sin tratar la muestra (salvo mediante dilución, según la tabla de dilución).
Sin embargo, será necesario realizar los dos pasos necesarios de dilución.
Normalmente, las bebidas con 30-60 % (v/v) de etanol, una dilución de 1:10000 y volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(e) Determinación del etanol en el zumo de fruta, concentrados y bebidas similares.
La concentración de etanol en soluciones claras y neutrales en general se puede determinar sin tratar la muestra (salvo mediante dilución, según la tabla de dilución).
Cuando se utilice sin diluir, el pH de las soluciones ácidas se debe aumentar a un valor de 9,0 aproximado con 2 M NaOH. Los líquidos turbios en general solo hay que filtrarlos antes de la fase de dilución. Las soluciones coloreadas en general se pueden utilizar para el análisis después de diluirlas en una concentración adecuada de etanol. Sin embargo, si las soluciones coloreadas requieren un análisis sin diluir, se pueden decolorar de la siguiente forma: trate la solución con polivinilpolipirrolidona (PVPP) o carbón activado a 2 g/100 mL y filtrelo en papel Whatman Nº 1.
Normalmente, no se requiere dilución y serán necesarios volúmenes de muestra de hasta 0,5 mL.